中药材专用赭曲霉毒素A免疫亲和柱说明书

1、用途：

免疫亲和柱可选择性吸附中药材样品液中的赭曲霉毒素A，从而对样品起到非常针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直接用于HPLC分析或氮吹复溶后用LC-MS/MS检测。

2、概述：

赭曲霉毒素A（OhratoxinA，OTA），是由曲霉属和青霉属的某些菌种产生的有毒代谢物，是一种具有强肾脏毒和肝脏毒的真菌毒素，并有致畸、致突变和致癌作用。

3、原理：

测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到分析仪器中用于检测。

4、包装组成：

每一个盒中包括各种规格的赭曲霉毒素A免疫亲和柱及1份说明书。

5、需要的材料但盒中不提供：

5.1设备及耗材

----HPLC/LC-MS/MS

----气控操作架

----空气泵

----天平

----高速均质器（转速≥10,000/min）或摇床

----粉碎机

----分样筛

----量筒：100mL/10mL

----注射器：20mL

----移液器或移液管：1mL

----均质杯（或250mL具塞锥型瓶）

-----样品瓶

-----量瓶

5.2试剂

----甲醇（CH₃OH）：提取过程用分析纯/洗脱过程用色谱纯

----氯化钠（NaCl）：分析纯

----盐酸（HCl）：分析纯

----氢氧化钠(NaOH）：分析纯

----磷酸氢二钠（NaH₂PO₄）：分析纯

----磷酸二氢钾（KH₂PO₄）：分析纯

----KCl：分析纯

----吐温-20（C₅₈H₁₁₄O₂₆）：分析纯

----水（H₂O）：蒸馏水或去离子

6、注意事项：

----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。

----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。

----请在有效日期内使用免疫亲和柱。

----须排空亲和柱内液体再进行上样操作。

----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。

----柱容量：柱容量是200ng，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。

----pH：亲和柱的上样溶液pH需在6～8之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调节pH。

----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。

----赭曲霉毒素可致癌，应戴手套口罩等防护工具操作。

----使用过的容器及标准品溶液用次氯酸钠溶液（5%V/V）浸泡过夜。

7、试液的配制：

7.1提取液

70%甲醇-水溶液（V甲醇:V水=70:30）：取700mL甲醇，加入去离子水定容至1L。

7.2磷酸盐缓冲溶液（简称：PBS）

称取8.00g氯化钠、1.20g磷酸氢二钠（或2.92g十二水磷酸氢二钠）、0.20g磷酸二氢钾、0.20g KCL，用900mL水溶解，用盐酸调节PH至7.0±0.1，加水稀释至1000mL。

7.3磷酸盐吐温缓冲液（简称：PBST）

取1mL 吐温-20，PBS缓冲液稀释定容至1000mL。

8、样品处理：

----3g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），3g氯化钠于均质瓶中，加入60mL的提取液（见7.1）；

----高速均质（≥10,000r/min）2min；

----离心10min（8000r/min）；

----取5mL上清液置50mL量瓶中，用PBS缓冲液稀释至刻度，混匀，离心15min（8000r/min）；

----取20mL上清液过免疫亲和柱净化。

稀释倍数：10

9、操作程序：

9.1上样

----取出免疫亲和柱，将注射器筒的下端直接穿透亲和柱上

方的塞子，完成注射器筒与亲和柱的连接，将其放置在气控操作架上进行固定；

----排空亲和柱内液体后，取步骤8中上样液，注入到注射器筒中；

----使液体以1~2滴/秒的速度流出；

9.2洗涤

----待液体排干；

----依次用10mLPBST缓冲液（见7.3），10mL水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；

9.3洗脱

----待液体排干后，取下针筒，吹干亲和柱中液体，用1.5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于2mL进样瓶中，用水稀释至刻度，混匀；

----用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。

*每次上样前都要将上次液体排干。

10、结果判读：

赭曲霉毒素A的含量=检测浓度×稀释倍数

11、贮藏条件及有效期：

贮藏条件：2~8℃。

有效期：该产品有效期为18个月。